实验原理

pTYNE载体在EGFP编码框上游有2个错码的ATG起始密码子，由于不能有效地启动EGFP表达，pTYNE转染细胞仅能发出很微弱的荧光。我们根据pTYNE载体上错码的EGFP的上游区域设计并构建了Cas9蛋白基因敲除实验的阳性对照gRNA表达载体pGR-Hygro-P。
pTYNE载体和阳性对照gRNA表达载体共转染Cas9表达细胞，gRNA指引Cas9蛋白对pTYNE载体上的错码EGFP基因切割。细胞对断裂的DNA进行修复，产生正确的EGFP基因，发出明亮的绿色荧光。
通过pTYNE载体实验可以检测Cas9蛋白表达细胞系是否构建成功。

pGR-Hygro-P阳性对照载体靶序列：CTTCGAATTCTGCAGTCGA。该靶点位于pTYNE EGFP基因上游。

pGR-Hygro-N阴性对照载体靶序列：ATCGACTAGCCACTCAGAC。该序列为随机序列。

pGR-Hygro-P靶点在pTYNE载体上的位置:

Cas9切割原理:

pGR-Hygro载体图谱：

实验内容

1、实验材料

pTYNE质粒（验证载体，无内毒素试剂盒制备；货号：CR1011）

pGR-Hygro-P质粒（阳性对照，无内毒素试剂盒制备；货号CR1022）
pGR-Hygro-N质粒（阴性对照，无内毒素试剂盒制备；货号CR1022）
Cas9蛋白表达293T细胞系（货号：C1203）

Polyfect-V转染试剂（货号：P2010-1）

2、实验步骤

1) 转染前24小时将293T-Cas9铺到24孔板中。同时准备2个孔。
2) 按照下列体系制备2个质粒稀释液

3) 准备转染试剂稀释液：
Polyfect-V转染试剂 3.2ul
DMEM培养基 96.8ul
4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育15min。
5) 将转染液加入293T-Cas9细胞。
6) 48小时后检测EGFP荧光表达。

实验结果