实验原理

TP53是重要的抑癌基因。在多种肿瘤中都能发现TP53基因突变及功能丧失。我们将针对TP53基因设计的靶点构建到pCas9/gRNA1载体，转染293T细胞，构建了TP53基因敲除293T细胞系。

1、本实验基因敲除原理：pCas9/gRNA1载体表达gRNA和Cas9蛋白。将靶点序列克隆到pCas9/gRNA1载体上，gRNA将诱导Cas9蛋白对靶点DNA进行切割，造成DNA断裂。细胞通过邻端连接( nonhomologous end-joining)修复重新连接DNA，造成靶点附近DNA序列缺失突变。

Cas9切割原理:

2、pTYNE载体靶点验证原理：将包括靶点在内的大约200bp基因组序列克隆到pTYNE载体。构建好的pTYNE载体与pCas9/gRNA1基因敲除载体共转染293T细胞。如果靶点有效，基因敲除载体对pTYNE载体载体切割，经过细胞修复后pTYNE上移码突变的EGFP基因得到修复，发出绿色荧光。

3、阳性细胞筛选原理：pCas9/gRNA1载体本身不带筛选标签。我们用带有嘌呤霉素和EGFP标签的载体pLV-EGFP（2A)puro和pCas9/gRNA1载体共转染，再用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。

 

简要步骤

设计靶点→构建pCas9/gRNA1载体→pTYNE验证靶点→pCas9/gRNA1载体转染293T细胞→挑选培养细胞克隆→测序验证基因敲除

 

靶点设计和基因敲除载体构建

人TP53基因有多个mRNA和蛋白拷贝，2个转录起始位点，以及多个翻译位点。我们在TP53基因的第四外显子设计了2个CRISPR基因敲除靶点，以实现对所有TP53蛋白的编辑。

靶点序列1：acctgccctgtgcagctgt

靶点序列2：ttgattccacacccccgcc

将靶点1和靶点2构建到pCas9/gRNA1载体，获得针对TP53基因的gRNA基因敲除载体pCas9/gRNA1-P531和pCas9/gRNA1-P532。构建方法同pCas9/gRNA1使用说明中的方法。

 

 

靶点验证

1、pTYNE-53验证载体构建

为了验证基因敲除靶点的效率，我们把TP53第四外显子部分序列通过XhoI、HindIII酶切位点连接到pTYNE载体，通过pTYNE载体验证靶点的切割效率。构建完成的载体命名为pTYNE-53。

构建完成后pTYNE-53载体序列：

注： 黄色：CMV promoter；灰色：TP53第四外显子部分序列；绿色：EGFP序列；下划线：CRISPR靶点

 

2、用pTYNE-53验证靶点

1) 转染前24小时将293T铺到24孔板中。同时准备3个孔。
2) 按照下列体系制备2个质粒稀释液

组1（阴性对照）	组2（靶点一）	组3（靶点二）
pTYNE-53 0.4ug	pTYNE-53 0.4ug	pTYNE-53 0.4ug
pCas9/gRNA1空载体0.4ug	pCas9/gRNA1-P531 0.4ug	pCas9/gRNA1-P532 0.4ug
DMEM培养基X ul	DMEM培养基 X ul	DMEM培养基 X ul
总体积50ul	总体积50ul	总体积50ul

3) 准备转染试剂稀释液：
Polyfect-V转染试剂 4.8ul
DMEM培养基 145.2ul
4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育15min。
5) 将转染液加入293T细胞。
6) 48小时后检测EGFP荧光表达。

验证实验结果

图一：靶点效率检测。转染48小时候荧光照片。

检测结果显示靶点一和靶点二均有效果，靶点一的效果优于靶点二。

 

 

TP53基因敲除293T细胞筛选

实验步骤

1) 转染前24小时将293T铺到6孔板中。
2) 按照下列体系制备质粒稀释液

pCas9/gRNA1-P531 0.7ug

pLV-EGFP（2A）puro 0.1ug

DMEM培养基X ul

总体积50ul

3) 准备转染试剂稀释液：
Polyfect-V转染试剂 1.6ul
DMEM培养基 48.4ul
4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取50ul转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育15min。
5) 将转染液加入293T细胞。
6) 48小时后加入puromycin至终浓度为3ug/ml。

7）筛选3天后消化细胞，用有限稀释法将细胞接种到394孔板，标记单个细胞的孔，做单克隆细胞培养。培养时不加puromycin。

8）约7-10天，细胞形成克隆。消化细胞，将部分细胞继续培养，部分细胞提取基因组DNA检测TP53基因敲除结果。

 

克隆检测结果

以细胞克隆提取出的基因组DNA为模板，PCR扩增TP53第4外显子基因序列，并测序。

测序的20个克隆结果如下：

单敲除细胞克隆	12个
双敲除细胞克隆	2个
未突变细胞克隆	6个
合计	20个

 

测序结果截图：

 

用到的产品：

pTYNE载体 货号：CR1011

pCas9/gRNA1载体 货号：CR1001